cancerspЮжно-Российский онкологический журнал/ South Russian Journal of CancerSouth Russian Journal of Cancer2686-9039АНО "Перспективы онкологии"10.37748/2686-9039-2023-4-2-5FOOTTTcancersp-222Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESКультивирование клеток в альгинатных каплях, как высокопроизводительный метод получения клеточных сфероидов для биопечатиCultivation of cells in alginate drops as a high-performance method of obtaining cell spheroids for bioprintinghttps://orcid.org/0000-0002-4558-5896ФилипповаС. Ю.FilippovaS. Yu.

 

Филиппова Светлана Юрьевна – научный сотрудник лаборатории клеточных технологий, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4558-5896, SPIN: 9586-2785, AuthorID: 791081, ResearcherID: AAH-4408-2020, Scopus Author ID: 57189618843

 

Svetlana Yu. Filippova – research fellow at the laboratory of cell technologies, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6035-1756, SPIN: 9586-2785, AuthorID: 878784, ResearcherID: E-7496-2018, Scopus Author ID: 56381527400

filsv@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4555-8556ЧембароваТ. В.ChembarovaT. V.

 

Чембарова Татьяна Владимировна – младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4555-8556, SPIN: 5426-1873, AuthorID: 1051985, ResearcherID: AAR-3198-2021, Scopus Author ID: 57221303597

 

Tatiana V. Chembarova – junior research fellow at the laboratory of cell technologies, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4555-8556, SPIN: 5426-1873, AuthorID: 1051985, ResearcherID: AAR-3198-2021, Scopus Author ID: 57221303597

tanyshamova@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5945-5961ТимофееваС. В.TimofeevaS. V.

 

Тимофеева Софья Владимировна – научный сотрудник лаборатории клеточных технологий, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5945-5961, SPIN: 5362-1915, AuthorID: 1064599, ResearcherID: AAH-4834-2020, Scopus Author ID: 57243356500

 

Sofia V. Timofeeva – research fellow at the laboratory of cell technologies, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5945-5961, SPIN: 5362-1915, AuthorID: 1064599, ResearcherID: AAH-4834-2020, Scopus Author ID: 57243356500

timofeeva.sophia@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-7902-7278МежевоваИ. В.MezhevovaI. V.

 

Межевова Ирина Валентиновна – младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7902-7278, SPIN: 3367-1741, AuthorID: 1011695, ResearcherID: AAI-1860-2019, Scopus Author ID: 57296602900

 

Irina V. Mezhevova – junior research fellow at the laboratory of cell technologies, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7902-7278, SPIN: 3367-1741, AuthorID: 1011695, ResearcherID: AAI-1860-2019, Scopus Author ID: 57296602900

mezhevova88@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-3691-3317ГненнаяН. В.GnennayaN. V.

 

Гненная Надежда Владимировна – младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-3691-3317, SPIN: 9244-2318, AuthorID: 900758, ResearcherID: V-5582-2018, Scopus Author ID: 57214806863

 

Nadezhda V. Gnennaya – junior research fellow at the laboratory of cell technologies, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-3691-3317, SPIN: 9244-2318, AuthorID: 900758, ResearcherID: V-5582-2018, Scopus Author ID: 57214806863

ngnennaya@inbox.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6496-9641НовиковаИ. А.NovikovaI. A.

 

Новикова Инна Арнольдовна – к.м.н., заместитель генерального директора по науке, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6496-9641, SPIN: 4810-2424, AuthorID: 726229, ResearcherID: E-7710-2018, Scopus Author ID: 7005153343

 

Inna A. Novikova – Cand. Sci. (Med.), deputy director for science, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6496-9641, SPIN: 4810-2424, AuthorID: 726229, ResearcherID: E-7710-2018, Scopus Author ID: 7005153343

onko-sekretar@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6544-6113ЛаптеваТ. О.LaptevaT.  O.

 

Лаптева Татьяна Олеговна – заведующая патологоанатомическим отделением, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6544-6113, SPIN: 2771-3213, AuthorID: 849370

 

Tatiana O. Lapteva – head of the pathology department, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation.

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6544-6113, SPIN: 2771-3213, AuthorID: 849370

onko-sekretar@mail.ruФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава РоссииРоссияNational Medical Research Centre for OncologyRussian Federation202311052023424755Copyright © Филиппова С.Ю., Чембарова Т.В., Тимофеева С.В., Межевова И.В., Гненная Н.В., Новикова И.А., Лаптева Т.О., 20232023Филиппова С.Ю., Чембарова Т.В., Тимофеева С.В., Межевова И.В., Гненная Н.В., Новикова И.А., Лаптева Т.О.Filippova S.Y., Chembarova T.V., Timofeeva S.V., Mezhevova I.V., Gnennaya N.V., Novikova I.A., Lapteva T.O.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.cancersp.com/jour/article/view/222Цель исследования

Цель исследования. Тестирование протокола получения клеточных сфероидов культур рака молочной железы (РМЖ) для биопечати путём наращивания в альгинатных каплях.

Материалы и методы

Материалы и методы. Клетки культур BT-20 и MDA-MB-453 культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % FBS. Далее клетки снимали с пластика при помощи раствора трипсин- Версена и ресуспендировали в стерильном 2 % растворе альгината, приготовленном на DPBS, до концентрации 105 кл/мл. Раствор альгината с клетками исследуемых культур РМЖ медленно капали через иглу 30G в стерильный охлажденный раствор хлорида кальция (100 мМ) с высоты 10 см. После полимеризации альгинатные капли отмывали в среде DMEM и культивировали в течение двух недель в среде DMEM с добавлением 10 % FBS при 37 °C и 5,0 % СО2. Образующиеся в альгинате сфероиды фотографировали на 3-, 7-, 10- и 14-е сутки культивирования, после чего их извлекали из альгината путём выдерживания в 55мМ растворе цитрата натрия с добавлением 20мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и заключали в парафиновые блоки по стандартной методике с последующим гистологическим исследованием.

Результаты

Результаты. Клеточные сфероиды- клоны образовывались в обеих культурах уже на 3 сутки культивирования. С 3 по 10-е сутки в обеих культурах наблюдался равномерный рост клеточных сфероидов с постепенным замедлением увеличения размеров сфероидов к 14-му дню культивирования. Доля клеток, образовавших клоны (размером более 500 мкм2), на 10-е сутки составила 25,2 % ± 7,1 % (n = 25) в культуре BT-20 и 38,5 % ± 9,9 % (n = 25) в культуре MDA-MB-453. На 14-е сутки для ВТ-20 были характерны сфероиды, мало варьирующие по размеру и форме, средней площадью 1652 ± 175 мкм2, обладающие плотной структурой с ровными краями. Сфероиды из клеток культуры MDA-MB-453 оказались более рыхлыми и легко деформирующимися, их размеры и форма заметно варьировали, средняя площадь сфероидов составила 2785 ± 345 мкм2.

Заключение

Заключение. Получение сфероидов в альгинатных каплях уступает по скорости методам формирования клеточных конгломератов в висячих каплях или на микроячейках, однако превосходит эти методы по производительности, которая сравнима с получением сфероидов на низкоадгезивных подложках путём постоянного перемешивания среды. Кроме того, клональная природа получаемых сфероидов приводит к увеличению трат на проведение исследований и ограничивает, тем самым, их масштабируемость.

Purpose of the study

Purpose of the study. Testing the protocol of obtaining cell spheroids of breast cancer cell cultures for bioprinting by growing in alginate drops.

Materials and methods

Materials and methods. Cells of breast cancer cell lines BT-20 and MDA-MB-453 were cultured in DMEM medium supplemented with 10 % FBS. Next, the cells were removed from the plastic using a trypsin-V ersene solution and resuspended in a sterile 2 % alginate solution in DPBS to the concentration of 105 cells/ml. Then the alginate solution with the cells was slowly dripped through a 30G needle into a sterile cooled solution of calcium chloride (100 mM) from a height of 10 cm. After polymerization, alginate drops were washed in DMEM and cultured for two weeks in DMEM with the addition of 10 % FBS at 37 °C and 5.0 % CO2.The spheroids formed in the alginate were photographed on the 3rd, 7th, 10th, and 14th days of cultivation, after which they were removed from the alginate by keeping in 55 mM sodium citrate solution with the addition of 20mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and embedded in paraffin blocks according to the standard method, followed by histological examination.

Results

Results. Cellular spheroids were formed in both cell cultures already on the 3rd day of cultivation. From the 3rd to the 10th day in both cultures, a uniform growth of cell spheroids was observed with a gradual slowdown in the increase in the size of spheroids by the 14th day of cultivation. On the 10th day the proportion of cells that formed clones (more than 500 μm2 in size) was 25.2 % ± 7.1 % (n = 25) in the BT-20 culture and 38.5 % ± 9.9 % (n = 25) in MDA-MB-453 culture. On the 14th day, BT-20 culture was characterized by spheroids varying little in size and shape, with an average area of 1652 ± 175 µm2, having a dense structure with smooth edges. The spheroids in MDA-MB-453 culture turned out to be more loose and easily deformed, their size and shape varied noticeably, the average area of the spheroids was 2785 ± 345 µm2.

Conclusion

Conclusion. The production of spheroids in alginate drops is inferior in speed to the methods of forming cell conglomerates in hanging drops or on microwells, but it surpasses these methods in productivity, which is comparable to the production of spheroids by constant medium stirring on low-adhesive substrates. In addition, the clonal nature of the obtained spheroids leads to an increase in research costs and thus limits their scalability.

трёхмерная клеточная культураклеточный сфероидальгинатбиопечать.3D cell culturecell spheroidalginatebioprintingReferencesАфонин Г. В., Рагулин Ю. А., Гулидов И. А. Ускоренные режимы адъювантной лучевой терапии в лечении рака молочной железы. Исследования и практика в медицине. 2017;4(3):66–74. https://doi.org/10.17709/2409-2231-2017-4-3-6, EDN: ZGIHQHAfonin GV, Ragulin YuA, Gulidov IA. Accelerated regimens of adjuvant radiotherapy in the treatment of breast cancer. Research and Practical Medicine Journal. 2017;4(3):66–74. (In Russ.). https://doi.org/10.17709/2409-2231-2017-4-3-6, EDN: ZGIHQHБалыкова Л. А., Инчина В. И., Тарасова Т. В., Мосина Л. М., Гвоздикова Е. Н., Хайдар Д. А. и др. Эффективность липосомального доксорубицина гидрохлорида в комбинации с циклофосфаном в лечении рака молочной железы в эксперименте. Исследования и практика в медицине. 2021;8(4):23–32. https://doi.org/10.17709/2410-1893-2021-8-4-2, EDN: ALOTUBVykhristyuk YuV, Roitberg GE, Dorosh JV, Karaseva NV, Akobova RA. Preventive measures against development of breast cancer. South Russian Journal of Cancer. 2021;2(1):50–56. https://doi.org/10.37748/2686-9039-2021-2-1-6, EDN: LXFIJGРойтберг Г. Е., Дорош Ж. В., Аникеева О. Ю. Лечение трижды негативного рака молочный железы у пациентки с метаболическим синдромом. Исследования и практика в медицине. 2021;8(1):62–68. https://doi.org/10.17709/2409-2231-2021-8-1-6, EDN: HKVAWJBalykova LA, Inchina VI, Tarasova TV, Mosina LM, Gvozdikova EN, Khaydar DA, et al. The effectiveness of liposomal doxorubicin hydrochloride in combination with cyclophosphan in the treatment of breast cancer in an experiment. Research and Practical Medicine Journal. 2021;8(4):23–32. (In Russ.). https://doi.org/10.17709/2410-1893-2021-8-4-2, EDN: ALOTUBЗубарева Е. Ю., Сеньчукова М. А., Вирич Е. В., Зубарев М. Р., Гончарова М. А. Уровни HIF-1α и TGF-β1 в сыворотке крови в зависимости от клинико-морфологических характеристик и чувствительности рака молочной железы к неоадъювантной химиотерапии. Исследования и практика в медицине. 2021;8(4):53–64. https://doi.org/10.17709/2410-1893-2021-8-4-5, EDN: GLUUQDVladimirova LYu, Storozhakova AE, Snezhko TA, Strakhova LK, Abramova NA, Kabanov SN, et al. Hormone-positive HER2-negative metastatic breast cancer: decision making in real clinical practice. South Russian Journal of Cancer. 2020;1(2):46–51. https://doi.org/10.37748/2687-0533-2020-1-2-6, EDN: GKSYDZЗлокачественные новообразования в России в 2020 году (заболеваемость и смертность). Под ред. А. Д. Каприна, В. В. Старинского, А. О. Шахзадовой. М.: МНИОИ им. П. А. Герцена – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. 2021, 252 с. Доступно по: https://oncology-association.ru/wp-content/uploads/2021/11/zis-2020elektronnaya-versiya.pdf, Дата обращения: 29.12.2022.Roitberg GE, Dorosh JV, Anikeeva OYu. Treatment of thrice-negative breast cancer in a patient with metabolic syndrome. Research and Practical Medicine Journal. 2021;8(1):62–68. (In Russ.). https://doi.org/10.17709/2409-2231-2021-8-1-6, EDN: HKVAWJГалимова Э. С., Галагудза М. М. Двухмерные и трехмерные модели культур клеток опухолей in vitro: преимущества и недостатки. Бюллетень сибирской медицины. 2018;17(3):188–196. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2018-3-188-196, EDN: VJUHHBZubareva EYu, Senchukova MA, Virich EV, Zubarev MR, Goncharova MA. Serum HIF-1α and TGF-β1 levels depending on the clinical and morphological characteristics of breast cancer and sensitivity of tumor to neoadjuvant chemotherapy. Research and Practical Medicine Journal. 2021;8(4):53–64. (In Russ.). https://doi.org/10.17709/2410-1893-2021-8-4-5, EDN: GLUUQDКит О. И., Шатова Ю. С., Новикова И. А., Владимирова Л. Ю., Ульянова Е. П., Комова Е. А. и др. Экспрессия Р53 и BCL2 при различных подтипах рака молочной железы. Фундаментальные исследования. 2014;(10-1):85–88. EDN: SMJMCLMalignant neoplasms in Russia in 2021 (morbidity and mortality). Ed. by Kaprin AD, Starinsky VV, Shahzadova AO. Moscow: P. A. Herzen MNIOI – Branch of the National Medical Research Radiological Center. 2021, 252 p. Available at: https://oncology-association.ru/wp-content/uploads/2021/11/zis-2020-elektronnaya-versiya.pdf, Accessed: 29.12.2022. (In Russ.)Тимофеева С. В., Шамова Т. В., Ситковская А. О. 3D-биопринтинг микроокружения опухоли: последние достижения. Журнал общей биологии. 2021;82(5):389–400. https://doi.org/10.31857/S0044459621050067, EDN: GMEORZGalimova ES, Galagudza MM. Two-dimensional and three-dimensional cell culture models in vitro: pros and cons. Bulletin of Siberian Medicine. 2018;17(3):188–196. (In Russ.). https://doi.org/10.20538/1682-0363-2018-3-188-196, EDN: VJUHHBJubelin C, Muñoz-Garcia J, Griscom L, Cochonneau D, Ollivier E, Heymann MF, et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 2022 Sep 11;12(1):155. https://doi.org/10.1186/s13578-022-00887-3Kit OI, Shatova JuS, Novikova IA, Vladimirova LJu, Ul’janova EP, Komova EA, et al. P53 and BCL2 expression in different breast cancer subtypes. Fundamental’nye Issledovaniya. 2014;(10-1):85–88. (In Russ.). EDN: SMJMCLZhuang P, Chiang YH, Fernanda MS, He M. Using Spheroids as Building Blocks Towards 3D Bioprinting of Tumor Microenvironment. Int J Bioprint. 2021;7(4):444. https://doi.org/10.18063/ijb.v7i4.444Timofeeva SV, Shamova TV, Sitkovskaya AO. 3D Bioprinting of Tumor Microenvironment: Recent Achievements. Biology Bulletin Reviews. 2021;82(5):389–400. (In Russ.). https://doi:10.31857/S0044459621050067, EDN: GMEORZHamburger AW, Salmon SE. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 1977 Jul 29;197(4302):461–463. https://doi.org/10.1126/science.560061Jubelin C, Muñoz-Garcia J, Griscom L, Cochonneau D, Ollivier E, Heymann MF, et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 2022 Sep 11;12(1):155. https://doi.org/10.1186/s13578-022-00887-3Филиппова С. Ю., Ситковская А. О., Бондаренко Е. С., Новикова И. А., Харагезов Д. А., Позднякова В. В. и др. Опыт применения инкапсуляции в альгинат для исследования влияния EGF и FGF2 на пролиферацию клеток колоректального рака в условиях пониженной адгезии in vitro. Цитология. 2021;63(2):184–192. https://doi.org/10.31857/S0041377121020024, EDN: QMRKCIZhuang P, Chiang YH, Fernanda MS, He M. Using Spheroids as Building Blocks Towards 3D Bioprinting of Tumor Microenvironment. Int J Bioprint. 2021;7(4):444. https://doi.org/10.18063/ijb.v7i4.444Johnson PA, Menegatti S, Chambers AC, Alibhai D, Collard TJ, Williams AC, et al. A rapid high throughput bioprinted colorectal cancer spheroid platform forin vitrodrug- and radiation-response. Biofabrication. 2022 Nov 2;15(1). https://doi.org/10.1088/1758-5090/ac999fHamburger AW, Salmon SE. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 1977 Jul 29;197(4302):461–463. https://doi.org/10.1126/science.560061Филиппова С. Ю., Ситковская А. О., Тимофеева С. В., Чембарова Т. В., Межевова И. В., Гненная Н. В. и др. Опыт получения многокомпонентной трёхмерной клеточной модели опухолевого роста для молекулярно-генетических исследований рака молочной железы. Научное электронное периодическое издание ЮФУ «Живые и биокосные системы». 2022;(42). https://doi.org/10.18522/2308-9709-2022-42-9, EDN: WMULYRFilippova SYu, Sitkovskaya AO, Bondarenko ES, Novikova IA, Kharagezov DA, Pozdnyakova VV, et al. The Use of Alginate Encapsulation to Study EGF and FGF2 Effect on Colorectal Cancer Cells Proliferation in Low Adhesion Conditions in vitro. Tsitologiya. 2021;63(2):184–192. (In Russ.). https://doi.org/10.31857/S0041377121020024, EDN: QMRKCIAggarwal V, Miranda O, Johnston PA, Sant S. Three dimensional engineered models to study hypoxia biology in breast cancer. Cancer Lett. 2020 Oct 10;490:124–142. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2020.05.030Johnson PA, Menegatti S, Chambers AC, Alibhai D, Collard TJ, Williams AC, et al. A rapid high throughput bioprinted colorectal cancer spheroid platform forin vitrodrug- and radiation-response. Biofabrication. 2022 Nov 2;15(1). https://doi.org/10.1088/1758-5090/ac999fHompland T, Fjeldbo CS, Lyng H. Tumor Hypoxia as a Barrier in Cancer Therapy: Why Levels Matter. Cancers (Basel). 2021 Jan 28;13(3):499. https://doi.org/10.3390/cancers13030499Filippova SYu, Timofeeva SV, Chembarova TV, Mezhevova IV, Gnennaya NV, Novikova IA, et al. Experience in obtaining a multicomponent three‑dimensional cellular model of tumor growth for molecular genetic studies of breast cancer. The Journal "Live and Bio-Abiotic Systems". 2022;(42). (In Russ.). https://doi.org/10.18522/2308-9709-2022-42-9, EDN: WMULYRAggarwal V, Miranda O, Johnston PA, Sant S. Three dimensional engineered models to study hypoxia biology in breast cancer. Cancer Lett. 2020 Oct 10;490:124–142. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2020.05.030Aggarwal V, Miranda O, Johnston PA, Sant S. Three dimensional engineered models to study hypoxia biology in breast cancer. Cancer Lett. 2020 Oct 10;490:124–142. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2020.05.030Hompland T, Fjeldbo CS, Lyng H. Tumor Hypoxia as a Barrier in Cancer Therapy: Why Levels Matter. Cancers (Basel). 2021 Jan 28;13(3):499. https://doi.org/10.3390/cancers13030499Hompland T, Fjeldbo CS, Lyng H. Tumor Hypoxia as a Barrier in Cancer Therapy: Why Levels Matter. Cancers (Basel). 2021 Jan 28;13(3):499. https://doi.org/10.3390/cancers13030499

The authors declare that there are no conflicts of interest present.