Златник Елена Юрьевна – д.м.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории иммунофенотипирования опухолей, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
ORCID:
Elena Yu. Zlatnik – Dr. Sci. (Med.), MD, Professor, Chief Researcher, Laboratory of Immunophenotyping of Tumors, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation
ORCID:
Енин Ярослав Сергеевич – младший научный сотрудник лаборатории молекулярной онкологии, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
ORCID:
Yaroslav S. Enin – Junior Researcher, Laboratory of Molecular Oncology, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation
ORCID:
Буров Олег Николаевич – к.х.н., доцент кафедры природных и высокомолекулярных соединений химического факультета, ФГАОУ ВО «Южный федеральный университет», Ростов-на-Дону, Российская Федерация
ORCID:
Oleg N. Burov – Cand. Sci. (Chem.), Associate Professor, Department of Natural and High Molecular Compounds, Faculty of Chemistry, Southern Federal University, Rostov-on-Don, Russian Federation
ORCID:
Бондаренко Елена Сергеевна – младший научный сотрудник лаборатории иммунофенотипирования опухолей, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
ORCID:
Elena S. Bondarenko – Junior Researcher, Laboratory of Immunophenotyping of Tumors, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation
ORCID:
Сагакянц Александр Борисович – к.б.н., заведующий лабораторией иммунофенотипирования опухолей, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
ORCID:
Alexander B. Sagakyants – Cand. Sci. (Biol.), Head of the Laboratory of Immunophenotyping of Tumors, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation
ORCID:
Кутилин Денис Сергеевич – к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной онкологии, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
ORCID:
Denis S. Kutilin – Cand. Sci. (Biol.), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Oncology, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation
ORCID:
Дзигунова Юлия Викторовна – старший преподаватель кафедры ботаники академии биологии и биотехнологии им. Д. И. Ивановского, ФГАОУ ВО «Южный федеральный университет», г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
SPIN: 2204-2967, AuthorID: 1062681
Yulia V. Dzigunova – Senior Lecturer, Department of Botany, Academy of Biology and Biotechnology. DI. Ivanovoskogo Southern Federal University, Rostov-on-Don, Russian Federation
SPIN: 2204-2967, AuthorID: 1062681
Новикова Инна Арнольдовна – д.м.н., заместитель генерального директора по науке, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
ORCID:
Inna A. Novikova – Dr. Sci. (Med.), MD, deputy director for science, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation
ORCID:
Пржедецкий Юрий Валентинович – д.м.н., профессор, заведующий отделением реконструктивно-пластической хирургии и онкологии, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
ORCID:
Yury V. Przhedetskiy – Dr. Sci. (Med.), MD, Professor, Head of the Department of Reconstructive Plastic Surgery and Oncology, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation
ORCID:
Цель исследования. Оценить клеточные, геномные (копийность генов) и транскриптомные (экспрессия генов) эффекты вторичных метаболитов P. hybridus (L.) при их воздействии на клеточную линию HeLa.
Материалы и методы. Выделение вторичных метаболитов из растительного материала и его идентификацию проводили методом препаративной хроматографии, определение состава – с помощью масс-спектрометрического анализа, окончательную верификацию структурных формул – методом ядерно-магнитного резонанса на кафедре природных соединений химического факультета ФГАОУ ВО «Южный федеральный университет». Следующую часть исследования выполняли с использованием культуральных и молекулярных методов. Культивирование HeLa проводили в стандартных условиях в среде MEM. При достижении 75–80 % уровня конфлюэнтности заменяли питательную среду с внесением исследуемых соединений (в концентрации 4 мкг/мл) и культивировали 72 ч. Смертность клеток определяли на счетчике NanoEnTek JuliFl (Корея) в присутствии 0,4 % трипанового синего. Оценку апоптоза после воздействия вторичных метаболитов проводили на проточном цитофлюориметре BD FACSCanto II с помощью FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I. Оценку уровня копийности и экспрессии генов, ответственных за апоптоз, выполняли методом цифровой капельной полимеразной цепной реакции (ПЦР) (DD-PCR).
Результаты. Были выделены и верифицированы следующие соединения, которым для упрощения использования в эксперименте были присвоены следующие порядковые номера: № 2 – 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one, № 3 – 5-(hydroxymethyl)furan-2-carbaldehyde, № 5.3 – 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde P. hibridus (L.). На этапе оценки клеточной гибели было обнаружено, что наибольший эффект достигается у соединения под порядковым № 2. Однако оценка показателей копийности и экспрессии генов CASP8, CASP9, CASP3, BAX, BCL2, TP53, MDM2, CDKN1B, CDK1, CCND1, CCND3 и RB1 методом DD-PCR выявила наличие инициации апоптоза в опухолевых клетках на молекулярном уровне под действием соединений под № 2 и № 5.3, полученных из P. hibridus (L.).
Заключение. Получены результаты разнонаправленного характера. Из всех использованных в эксперименте соединений выраженный цитостатический эффект выявлен только у соединения 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one. В то же время при использовании соединения 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde выявлено увеличение экспрессии генов CASP3, CASP8, TP53, BAX.
Purpose of the study. To evaluate the cellular, genomic (gene copy number) and transcriptomic (gene expression) effects of P.hybridus (L.) secondary metabolites when they affect the HeLa cell line.
Materials and methods. The isolation of secondary metabolites from plant material and its identification were carried out by preparative chromatography. The composition was determined using mass spectrometric analysis, and the final verification of structural formulas was carried out by nuclear magnetic resonance at the Department of Natural Compounds, the Faculty of Chemistry of the Southern Federal University. The subsequent phase of the study was conducted using both cultural and molecular methods. HeLa cells were cultivated under standard conditions in a MEM medium. Once the confluence level was reached 75–80 %, the nutrient medium was replaced with the introduction of the studied compounds (at a concentration of 4 micrograms/ml) and cultivated for 72 hours. Cell mortality was determined using a NanoEnTek JuliFl counter (Korea) in the presence of 0.4 % trypan blue. The assessment of apoptosis following secondary metabolite exposure was conducted on a BD FACSCanto II flow cytometer using the FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I. The level of replication and expression of the genes responsible for apoptosis was assessed by digital droplet PCR (ddPCR).
Results. The following compounds were isolated and verified, and were assigned the following sequence numbers to facilitate their use in the experiment: No. 2 – 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one, No. 3 – 5-(hydroxymethyl) furan-2-carbaldehyde, No. 5.3 – 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde, P. hybridus (L.) At the stage of cell death assessment, it was found that the greatest effect was achieved in the compound under ordinal No. 2. However, the evaluation of the copy number and expression of the CASP8, CASP9, CASP3, BAX, BCL2, TP53, MDM2, CDKN1B, CDK1, CCND1, CCND3, and RB1 genes by DD-PCR revealed the presence of apoptosis initiation in tumor cells at the molecular level under the action of compounds No. 2 and No. 5.3 obtained from P. hybridus (L.).
Conclusion. The outcomes were multifeatured. Only compound 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one exhibited a pronounced cytostatic effect out of all compounds utilized in the experiment. Concurrently, the compound 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde was found to induce an increase in the expression of the CASP3, CASP8, TP53, and BAX genes.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.