Применение силиконового покрытия для оптимизации процесса получения клеточных сфероидов методом висячей капли

Цель исследования. Исследовать влияние покрытия из СИЭЛ 159–330 на скорость и характер образования клеточных скоплений в висячей капле в сочетании с применением метилцеллюлозы (МЦ) и коллагена в качестве агентов, улучшающих агрегацию клеток.
Материалы и методы. Клетки культуры рака молочной железы ВТ20 в количестве 104  помещали в каплях объёмом 20 мкл на крышку полистироловой чашки Петри с покрытием из силиконового эластомера СИЭЛ 159–330 (АО «ГНИИХТЭОС», г. Москва, Россия) или без покрытия. В исследовании тестировали по три концентрации МЦ (0,1 %, 0,25 % и 0,4 %) и коллагена (150 мкг/мл, 300 мкг/мл и 600 мкг/мл). Скорость формирования клеточных конгломератов оценивали через изменение их площади спустя 4, 24, 48 и 72 часа культивирования.
Результаты. Применение покрытия из СИЭЛ 159–330 позволило получить сфероиды таких же размеров, что и добавление 0,4 % МЦ на временном промежутке 72 часа. Силиконовое покрытие дополнительно уменьшило размеры клеточных сфероидов в среде с 0,1 % МЦ во всех временных точках, однако с ростом концентрации МЦ данный эффект исчезал. Кроме того, использование СИЭЛ 159–330 уменьшило связь размеров клеточных сфероидов с концентрацией МЦ, что позволяет рассматривать применение данного покрытия, как альтернативу МЦ или способ сократить её концентрацию. В опыте с добавлением в среду культивирования коллагена размеры клеточных конгломератов, образующихся на силиконовом покрытии, были достоверно меньше, чем на пластике без покрытия во всех вариантах опыта и временных точках. При этом эффект был более выраженным для концентрации коллагена 600 мкг/мл. Применение покрытия из СИЭЛ 159–330, кроме того, сократило вариативность размеров и формы образующихся клеточных конгломератов.
Заключение. Ускоренная агрегация клеток и волокон внеклеточного матрикса в висячих каплях, а также сокращение вариативности в размерах и форме образующихся клеточных скоплений на СИЭЛ 159–330 позволяет сократить время проведения экспериментов и материальные затраты, как в опытах с добавлением веществ, ускоряющих формирование сфероидов (МЦ и коллаген), так и в их отсутствие.

1. Кит О. И., Шатова Ю. С., Новикова И. А., Владимирова Л. Ю., Ульянова Е. П., Комова Е. А. и др. Экспрессия Р53 и BCL2 при различных подтипах рака молочной железы. Фундаментальные исследования. 2014;(10-1):85–88. Доступно по: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=35219, Дата обращения: 16.03.2022.

2. Тимофеева С. В., Шамова Т. В., Ситковская А. О. 3D-биопринтинг микроокружения опухоли: последние достижения. Журнал общей биологии. 2021;82(5):389–400. https://doi.org/10.31857/S0044459621050067

3. Liu D, Chen S, Win Naing M. A review of manufacturing capabilities of cell spheroid generation technologies and future development. Biotechnol Bioeng. 2021 Feb;118(2):542–554. https://doi.org/10.1002/bit.27620

4. Kelm JM, Timmins NE, Brown CJ, Fussenegger M, Nielsen LK. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 2003 Jul 20;83(2):173–180. https://doi.org/10.1002/bit.10655

5. Ivascu A, Kubbies M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 2007 Dec;31(6):1403–1413. https://doi.org/10.3892/ijo.31.6.1403

6. Leung BM, Lesher-Perez SC, Matsuoka T, Moraes C, Takayama S. Media additives to promote spheroid circularity and compactness in hanging drop platform. Biomater Sci. 2015 Feb;3(2):336–344. https://doi.org/10.1039/c4bm00319e

7. Huang H, Wright S, Zhang J, Brekken RA. Getting a grip on adhesion: Cadherin switching and collagen signaling. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2019 Nov;1866(11):118472. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2019.04.002

8. Шамова Т. В., Ситковская А. О., Росторгуев Э. Е., Кузнецова Н. С., Кавицкий С. Э. Получение первичных клеточных линий глиальных опухолей. Пермский медицинский журнал. 2020;37(5):79–89. https://doi.org/10.17816/pmj37579-89

9. Dalir Abdolahinia E, Jafari B, Parvizpour S, Barar J, Nadri S, Omidi Y. Role of cellulose family in fibril organization of collagen for forming 3D cancer spheroids: In vitro and in silico approach. Bioimpacts. 2021;11(2):111–117. https://doi.org/10.34172/bi.2021.18

10. Oliveira MB, Neto AI, Correia CR, Rial-Hermida MI, Alvarez-Lorenzo C, Mano JF. Superhydrophobic chips for cell spheroids high-throughput generation and drug screening. ACS Appl Mater Interfaces. 2014 Jun 25;6(12):9488–9495. https://doi.org/10.1021/am5018607

11. Fu JJ, Lv XH, Wang LX, He X, Li Y, Yu L, et al. Cutting and Bonding Parafilm® to Fast Prototyping Flexible Hanging Drop Chips for 3D Spheroid Cultures. Cell Mol Bioeng. 2021 Apr;14(2):187–199. https://doi.org/10.1007/s12195-020-00660-x

12. Kuo CT, Wang JY, Lin YF, Wo AM, Chen BPC, Lee H. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Sci Rep. 2017 Jun 29;7(1):4363. https://doi.org/10.1038/s41598-017-04718-1

13. Нанушьян С. Р. Кремнийорганические материалы ускоренной вулканизации: история создания и развития направления. Химическая промышленность сегодня. 2015;(11):21–26.

14. Филиппова С. Ю., Ситковская А. О., Ващенко Л. Н., Кечеджиева Э. Э., Дашкова И. Р., Аушева Т. В. и др. Применение покрытия из силикона для получения клеточных сфероидов методом висячей капли. Журнал медико-биологических исследований. 2022;10(1):44–51. https://doi.org/10.37482/2687-1491-Z089

15. Ware MJ, Colbert K, Keshishian V, Ho J, Corr SJ, Curley SA, et al. Generation of Homogenous Three-Dimensional Pancreatic Cancer Cell Spheroids Using an Improved Hanging Drop Technique. Tissue Eng Part C Methods. 2016 Apr;22(4):312–321. https://doi.org/10.1089/ten.TEC.2015.0280