Культивирование клеток в альгинатных каплях, как высокопроизводительный метод получения клеточных сфероидов для биопечати

Цель исследования. Тестирование протокола получения клеточных сфероидов культур рака молочной железы (РМЖ) для биопечати путём наращивания в альгинатных каплях.

Материалы и методы. Клетки культур BT-20 и MDA-MB-453 культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % FBS. Далее клетки снимали с пластика при помощи раствора трипсин- Версена и ресуспендировали в стерильном 2 % растворе альгината, приготовленном на DPBS, до концентрации 10⁵ кл/мл. Раствор альгината с клетками исследуемых культур РМЖ медленно капали через иглу 30G в стерильный охлажденный раствор хлорида кальция (100 мМ) с высоты 10 см. После полимеризации альгинатные капли отмывали в среде DMEM и культивировали в течение двух недель в среде DMEM с добавлением 10 % FBS при 37 °C и 5,0 % СО₂. Образующиеся в альгинате сфероиды фотографировали на 3-, 7-, 10- и 14-е сутки культивирования, после чего их извлекали из альгината путём выдерживания в 55мМ растворе цитрата натрия с добавлением 20мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и заключали в парафиновые блоки по стандартной методике с последующим гистологическим исследованием.

Результаты. Клеточные сфероиды- клоны образовывались в обеих культурах уже на 3 сутки культивирования. С 3 по 10-е сутки в обеих культурах наблюдался равномерный рост клеточных сфероидов с постепенным замедлением увеличения размеров сфероидов к 14-му дню культивирования. Доля клеток, образовавших клоны (размером более 500 мкм²), на 10-е сутки составила 25,2 % ± 7,1 % (n = 25) в культуре BT-20 и 38,5 % ± 9,9 % (n = 25) в культуре MDA-MB-453. На 14-е сутки для ВТ-20 были характерны сфероиды, мало варьирующие по размеру и форме, средней площадью 1652 ± 175 мкм², обладающие плотной структурой с ровными краями. Сфероиды из клеток культуры MDA-MB-453 оказались более рыхлыми и легко деформирующимися, их размеры и форма заметно варьировали, средняя площадь сфероидов составила 2785 ± 345 мкм².

Заключение. Получение сфероидов в альгинатных каплях уступает по скорости методам формирования клеточных конгломератов в висячих каплях или на микроячейках, однако превосходит эти методы по производительности, которая сравнима с получением сфероидов на низкоадгезивных подложках путём постоянного перемешивания среды. Кроме того, клональная природа получаемых сфероидов приводит к увеличению трат на проведение исследований и ограничивает, тем самым, их масштабируемость.

1. Афонин Г. В., Рагулин Ю. А., Гулидов И. А. Ускоренные режимы адъювантной лучевой терапии в лечении рака молочной железы. Исследования и практика в медицине. 2017;4(3):66–74. https://doi.org/10.17709/2409-2231-2017-4-3-6, EDN: ZGIHQH

2. Балыкова Л. А., Инчина В. И., Тарасова Т. В., Мосина Л. М., Гвоздикова Е. Н., Хайдар Д. А. и др. Эффективность липосомального доксорубицина гидрохлорида в комбинации с циклофосфаном в лечении рака молочной железы в эксперименте. Исследования и практика в медицине. 2021;8(4):23–32. https://doi.org/10.17709/2410-1893-2021-8-4-2, EDN: ALOTUB

3. Ройтберг Г. Е., Дорош Ж. В., Аникеева О. Ю. Лечение трижды негативного рака молочный железы у пациентки с метаболическим синдромом. Исследования и практика в медицине. 2021;8(1):62–68. https://doi.org/10.17709/2409-2231-2021-8-1-6, EDN: HKVAWJ

4. Зубарева Е. Ю., Сеньчукова М. А., Вирич Е. В., Зубарев М. Р., Гончарова М. А. Уровни HIF-1α и TGF-β1 в сыворотке крови в зависимости от клинико-морфологических характеристик и чувствительности рака молочной железы к неоадъювантной химиотерапии. Исследования и практика в медицине. 2021;8(4):53–64. https://doi.org/10.17709/2410-1893-2021-8-4-5, EDN: GLUUQD

5. Злокачественные новообразования в России в 2020 году (заболеваемость и смертность). Под ред. А. Д. Каприна, В. В. Старинского, А. О. Шахзадовой. М.: МНИОИ им. П. А. Герцена – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. 2021, 252 с. Доступно по: https://oncology-association.ru/wp-content/uploads/2021/11/zis-2020elektronnaya-versiya.pdf, Дата обращения: 29.12.2022.

6. Галимова Э. С., Галагудза М. М. Двухмерные и трехмерные модели культур клеток опухолей in vitro: преимущества и недостатки. Бюллетень сибирской медицины. 2018;17(3):188–196. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2018-3-188-196, EDN: VJUHHB

7. Кит О. И., Шатова Ю. С., Новикова И. А., Владимирова Л. Ю., Ульянова Е. П., Комова Е. А. и др. Экспрессия Р53 и BCL2 при различных подтипах рака молочной железы. Фундаментальные исследования. 2014;(10-1):85–88. EDN: SMJMCL

8. Тимофеева С. В., Шамова Т. В., Ситковская А. О. 3D-биопринтинг микроокружения опухоли: последние достижения. Журнал общей биологии. 2021;82(5):389–400. https://doi.org/10.31857/S0044459621050067, EDN: GMEORZ

9. Jubelin C, Muñoz-Garcia J, Griscom L, Cochonneau D, Ollivier E, Heymann MF, et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 2022 Sep 11;12(1):155. https://doi.org/10.1186/s13578-022-00887-3

10. Zhuang P, Chiang YH, Fernanda MS, He M. Using Spheroids as Building Blocks Towards 3D Bioprinting of Tumor Microenvironment. Int J Bioprint. 2021;7(4):444. https://doi.org/10.18063/ijb.v7i4.444

11. Hamburger AW, Salmon SE. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 1977 Jul 29;197(4302):461–463. https://doi.org/10.1126/science.560061

12. Филиппова С. Ю., Ситковская А. О., Бондаренко Е. С., Новикова И. А., Харагезов Д. А., Позднякова В. В. и др. Опыт применения инкапсуляции в альгинат для исследования влияния EGF и FGF2 на пролиферацию клеток колоректального рака в условиях пониженной адгезии in vitro. Цитология. 2021;63(2):184–192. https://doi.org/10.31857/S0041377121020024, EDN: QMRKCI

13. Johnson PA, Menegatti S, Chambers AC, Alibhai D, Collard TJ, Williams AC, et al. A rapid high throughput bioprinted colorectal cancer spheroid platform forin vitrodrug- and radiation-response. Biofabrication. 2022 Nov 2;15(1). https://doi.org/10.1088/1758-5090/ac999f

14. Филиппова С. Ю., Ситковская А. О., Тимофеева С. В., Чембарова Т. В., Межевова И. В., Гненная Н. В. и др. Опыт получения многокомпонентной трёхмерной клеточной модели опухолевого роста для молекулярно-генетических исследований рака молочной железы. Научное электронное периодическое издание ЮФУ «Живые и биокосные системы». 2022;(42). https://doi.org/10.18522/2308-9709-2022-42-9, EDN: WMULYR

15. Aggarwal V, Miranda O, Johnston PA, Sant S. Three dimensional engineered models to study hypoxia biology in breast cancer. Cancer Lett. 2020 Oct 10;490:124–142. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2020.05.030

16. Hompland T, Fjeldbo CS, Lyng H. Tumor Hypoxia as a Barrier in Cancer Therapy: Why Levels Matter. Cancers (Basel). 2021 Jan 28;13(3):499. https://doi.org/10.3390/cancers13030499