Опыт создания первичных культур рака эндометрия и исследования в них клеток, обладающих фенотипом опухолевых стволовых клеток

Цель исследования. Изучить возможность применения метода сфероидообразования в культуре для оценки содержания опухолевых стволовых клеток (ОСК) рака эндометрия (РЭ) в сложных образцах, содержащих различные клетки опухоли и микроокружения.

Материалы и методы. Первичные культуры получали из фрагментов опухолей, удаленных в ходе оперативного вмешательства, проводимого в качестве первого этапа по лечению РЭ в отделении онкогинекологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации. После ферментативной дезагрегации ткани клеточную суспензию пассировали в среде DMEM, содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 1 % гентамицина, для получения первичных двумерных культур. Для изучения способности клеток к сфероидообразованию первичную культуру снимали с культурального пластика и пассировали по 2,0 × 10⁴ клеток на лунку 6-тилуночного планшета (n = 6) в среду DMEM, содержащую 0,35 % агарозы и факторы роста EGF (20 нг/мл) и FGF (20 нг/мл). Через две недели культивирования определяли средний размер, количество образующихся сфероидов и частоту сфероидообразования. Для тех культур, которые образовали сфероиды, было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание двумерной культуры на маркер CD133, после чего определяли частоту CD133+ клеток.

Результаты. Всего было получено девять первичных культур РЭ, из которых только пять образовали сфероиды спустя две недели культивирования в условиях, не поддерживающих адгезию. В этих культурах наибольшую связь со сфероидообразованием показали небольшие полигональные CD133+ клетки, с которыми ассоциировались наиболее крупные сфероиды (98–110 мкм в диаметре).

Заключение. В смешанных культурах РЭ присутствует большое количество клеток микроокружения, из которого часть клеток может экспрессировать CD133, в том числе нормальные стволовые клетки, также образующие сфероиды в мягком агаре. Требуется более подробное изучение клеточных субпопуляций РЭ в сравнении с нормальным эндометрием для установления связи между наблюдаемым разнообразием клеток в культуре и их способностью к сфероидообразованию и другими характеристиками ОСК.

1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021 May;71(3):209–249. https://doi.org/10.3322/caac.21660

2. Состояние онкологической помощи населению России в 2022 году. Под ред. А. Д. Каприна, В. В. Старинского, А. О. Шахзадовой М.: МНИОИ им. П. А. Герцена − филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2022, 239 с.

3. Giannone G, Attademo L, Scotto G, Genta S, Ghisoni E, Tuninetti V, et al. Endometrial Cancer Stem Cells: Role, Characterization and Therapeutic Implications. Cancers (Basel). 2019 Nov 19;11(11):1820. https://doi.org/10.3390/cancers11111820

4. Walcher L, Kistenmacher AK, Suo H, Kitte R, Dluczek S, Strauß A, et al. Cancer Stem Cells-Origins and Biomarkers: Perspectives for Targeted Personalized Therapies. Front Immunol. 2020;11:1280. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01280

5. Hubbard SA, Friel AM, Kumar B, Zhang L, Rueda BR, Gargett CE. Evidence for cancer stem cells in human endometrial carcinoma. Cancer Res. 2009 Nov 1;69(21):8241–8248. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-08-4808

6. Rahadiani N, Ikeda J ichiro, Mamat S, Matsuzaki S, Ueda Y, Umehara R, et al. Expression of aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) in endometrioid adenocarcinoma and its clinical implications. Cancer Sci. 2011 Apr;102(4):903–908. https://doi.org/10.1111/j.1349-7006.2011.01864.x

7. Lennartsson J, Rönnstrand L. Stem cell factor receptor/c-Kit: from basic science to clinical implications. Physiol Rev. 2012 Oct;92(4):1619–1649. https://doi.org/10.1152/physrev.00046.2011

8. Zhang X, Kyo S, Nakamura M, Mizumoto Y, Maida Y, Bono Y, et al. Imatinib sensitizes endometrial cancer cells to cisplatin by targeting CD117-positive growth-competent cells. Cancer Lett. 2014 Apr 1;345(1):106–114. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2013.11.020

9. Saygin C, Wiechert A, Rao VS, Alluri R, Connor E, Thiagarajan PS, et al. CD55 regulates self-renewal and cisplatin resistance in endometrioid tumors. J Exp Med. 2017 Sep 4;214(9):2715–2732. https://doi.org/10.1084/jem.20170438

10. Hassn Mesrati M, Syafruddin SE, Mohtar MA, Syahir A. CD44: A Multifunctional Mediator of Cancer Progression. Biomolecules. 2021 Dec 9;11(12):1850. https://doi.org/10.3390/biom11121850

11. Elbasateeny SS, Salem AA, Abdelsalam WA, Salem RA. Immunohistochemical expression of cancer stem cell related markers CD44 and CD133 in endometrial cancer. Pathol Res Pract. 2016 Jan;212(1):10–16. https://doi.org/10.1016/j.prp.2015.10.008

12. Park JY, Hong D, Park JY. Association between Morphological Patterns of Myometrial Invasion and Cancer Stem Cell Markers in Endometrial Endometrioid Carcinoma. Pathol Oncol Res. 2019 Jan;25(1):123–130. https://doi.org/10.1007/s12253-017-0320-5

13. Грабовенко Ф. И., Кисиль О. В., Павлова Г. В., Зверева М. Э. Белок CD133 как маркер опухолевых стволовых клеток. Журнал «Вопросы нейрохирургии» имени Н. Н. Бурденко. 2022;86(6):113–120. https://doi.org/10.17116/neiro202286061113, EDN: FYRKWQ

14. Rutella S, Bonanno G, Procoli A, Mariotti A, Corallo M, Prisco MG, et al. Cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the CD133 antigen in human endometrial tumors. Clin Cancer Res. 2009 Jul 1;15(13):4299–311. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-08-1883

15. Gao Y, Liu T, Cheng W, Wang H. Isolation and characterization of proliferative, migratory and multidrug-resistant endometrial carcinoma-initiating cells from human type II endometrial carcinoma cell lines. Oncol Rep. 2012 Aug;28(2):527–532. https://doi.org/10.3892/or.2012.1807

16. Friel AM, Zhang L, Curley MD, Therrien VA, Sergent PA, Belden SE, et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133 positive and negative endometrial cancer cells. Reprod Biol Endocrinol. 2010 Dec 1;8:147. https://doi.org/10.1186/1477-7827-8-147

17. Sun Y, Yoshida T, Okabe M, Zhou K, Wang F, Soko C, et al. Isolation of Stem-Like Cancer Cells in Primary Endometrial Cancer Using Cell Surface Markers CD133 and CXCR4. Transl Oncol. 2017 Dec;10(6):976–987. https://doi.org/10.1016/j.tranon.2017.07.007

18. Кутилин Д. С., Никитин И. С., Кит О. И. Особенности экспрессии генов некоторых транскрипционных факторов при малигнизации тканей тела матки. Успехи молекулярной онкологии. 2019;6(1):57–62. https://doi.org/10.17650/2313-805X-2019-6-1-57-62, EDN: KWOXFG

19. Mancebo G, Sole-Sedeno JM, Pino O, Miralpeix E, Mojal S, Garrigos L, et al. Prognostic impact of CD133 expression in Endometrial Cancer Patients. Sci Rep. 2017 Aug 9;7(1):7687. https://doi.org/10.1038/s41598-017-08048-0

20. Nakamura M, Kyo S, Zhang B, Zhang X, Mizumoto Y, Takakura M, et al. Prognostic impact of CD133 expression as a tumor-initiating cell marker in endometrial cancer. Hum Pathol. 2010 Nov;41(11):1516–1529. https://doi.org/10.1016/j.humpath.2010.05.006

21. Karbanová J, Missol-Kolka E, Fonseca AV, Lorra C, Janich P, Hollerová H, et al. The stem cell marker CD133 (Prominin-1) is expressed in various human glandular epithelia. J Histochem Cytochem. 2008 Nov;56(11):977–993. https://doi.org/10.1369/jhc.2008.951897

22. Pastrana E, Silva-Vargas V, Doetsch F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 2011 May 6;8(5):486–498. https://doi.org/10.1016/j.stem.2011.04.007

23. Helweg LP, Windmöller BA, Burghardt L, Storm J, Förster C, Wethkamp N, et al. The Diminishment of Novel Endometrial Carcinoma-Derived Stem-like Cells by Targeting Mitochondrial Bioenergetics and MYC. Int J Mol Sci. 2022 Feb 22;23(5):2426. https://doi.org/10.3390/ijms23052426

24. Chan RW, Schwab KE, Gargett CE. Clonogenicity of human endometrial epithelial and stromal cells. Biol Reprod. 2004 Jun;70(6):1738-50. https://doi.org/10.1095/biolreprod.103.024109

25. Schwab KE, Hutchinson P, Gargett CE. Identification of surface markers for prospective isolation of human endometrial stromal colony-forming cells. Hum Reprod. 2008 Apr;23(4):934–943. https://doi.org/10.1093/humrep/den051

26. Ситковская А. О., Златник Е. Ю., Филиппова С. Ю., Бондаренко Е. С., Ващенко Л. Н., Кечеджиева Э. Э. и др. Влияние интерлейкинов 2, 7, 15 на пролиферацию натуральных киллеров in vitro. Российский биотерапевтический журнал. 2021;20(1):56–66. https://doi.org/10.17650/1726-9784-2021-20-1-56-66, EDN: SKZQFC

27. Хаитов Р. М. Иммунология: учебник. 2-е изд. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015, 528 с.

28. Tabuchi Y, Hirohashi Y, Hashimoto S, Mariya T, Asano T, Ikeo K, et al. Clonal analysis revealed functional heterogeneity in cancer stem-like cell phenotypes in uterine endometrioid adenocarcinoma. Exp Mol Pathol. 2019 Feb;106:78–88. https://doi.org/10.1016/j.yexmp.2018.11.013

29. Ding DC, Liu HW, Chang YH, Chu TY. Expression of CD133 in endometrial cancer cells and its implications. J Cancer. 2017;8(11):2142–2153. https://doi.org/10.7150/jca.18869

30. Tárnok A, Ulrich H, Bocsi J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry A. 2010 Jan;77(1):6–10. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20844

31. Ulrich D, Tan KS, Deane J, Schwab K, Cheong A, Rosamilia A, et al. Mesenchymal stem/stromal cells in post-menopausal endometrium. Hum Reprod. 2014 Sep;29(9):1895–1905. https://doi.org/10.1093/humrep/deu159

32. Frąszczak K, Barczyński B. Characteristics of Cancer Stem Cells and Their Potential Role in Endometrial Cancer. Cancers (Basel). 2024 Mar 7;16(6):1083. https://doi.org/10.3390/cancers16061083