Клеточные, геномные и транскриптомные эффекты вторичных метаболитов Белокопытника гибридного на клеточную линию HeLa

Цель исследования. Оценить клеточные, геномные (копийность генов) и транскриптомные (экспрессия генов) эффекты вторичных метаболитов P. hybridus (L.) при их воздействии на клеточную линию HeLa.

Материалы и методы. Выделение вторичных метаболитов из растительного материала и его идентификацию проводили методом препаративной хроматографии, определение состава – с помощью масс-спектрометрического анализа, окончательную верификацию структурных формул – методом ядерно-магнитного резонанса на кафедре природных соединений химического факультета ФГАОУ ВО «Южный федеральный университет». Следующую часть исследования выполняли с использованием культуральных и молекулярных методов. Культивирование HeLa проводили в стандартных условиях в среде MEM. При достижении 75–80 % уровня конфлюэнтности заменяли питательную среду с внесением исследуемых соединений (в концентрации 4 мкг/мл) и культивировали 72 ч. Смертность клеток определяли на счетчике NanoEnTek JuliFl (Корея) в присутствии 0,4 % трипанового синего. Оценку апоптоза после воздействия вторичных метаболитов проводили на проточном цитофлюориметре BD FACSCanto II с помощью FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I. Оценку уровня копийности и экспрессии генов, ответственных за апоптоз, выполняли методом цифровой капельной полимеразной цепной реакции (ПЦР) (DD-PCR).

Результаты. Были выделены и верифицированы следующие соединения, которым для упрощения использования в эксперименте были присвоены следующие порядковые номера: № 2 – 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one, № 3 – 5-(hydroxymethyl)furan-2-carbaldehyde, № 5.3 – 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde P. hibridus (L.). На этапе оценки клеточной гибели было обнаружено, что наибольший эффект достигается у соединения под порядковым № 2. Однако оценка показателей копийности и экспрессии генов CASP8, CASP9, CASP3, BAX, BCL2, TP53, MDM2, CDKN1B, CDK1, CCND1, CCND3 и RB1 методом DD-PCR выявила наличие инициации апоптоза в опухолевых клетках на молекулярном уровне под действием соединений под № 2 и № 5.3, полученных из P. hibridus (L.).

Заключение. Получены результаты разнонаправленного характера. Из всех использованных в эксперименте соединений выраженный цитостатический эффект выявлен только у соединения 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one. В то же время при использовании соединения 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde выявлено увеличение экспрессии генов CASP3, CASP8, TP53, BAX.

1. Hegde YM, Theivendren P, Srinivas G, Palanivel M, Shanmugam N, Kunjiappan S, et al. A Recent Advancement in Nanotechnology Approaches for the Treatment of Cervical Cancer. Anticancer Agents Med Chem. 2023;23(1):37–59. https://doi.org/10.2174/1871520622666220513160706

2. Кутилин Д. С., Могушкова Х. А. Влияние противоопухолевых антибиотиков антрациклинового ряда на транскрипционную активность раково-тестикулярных антигенов в модельном эксперименте на клеточной линии HeLa. Медицинская иммунология. 2019;21(3):539–546. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2019-3-539-546, EDN: SIWZEN

3. Cox E. Performing HeLa: theatrical bodies and living remains. Med Humanit. 2023 Sep;49(3):447–456. https://doi.org/10.1136/medhum-2022-012524

4. Li Y, Kong D, Fu Y, Sussman MR, Wu H. The effect of developmental and environmental factors on secondary metabolites in medicinal plants. Plant Physiol Biochem. 2020 Mar;148:80–89. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2020.01.006

5. Fakhri S, Moradi SZ, Farzaei MH, Bishayee A. Modulation of dysregulated cancer metabolism by plant secondary metabolites: A mechanistic review. Semin Cancer Biol. 2022 May;80:276–305. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2020.02.007

6. Zagoskina NV, Nazarenko LV. Secondary Plant Metabolites: Distribution, History of Study, Practical Application Bulletin of the Moscow City Pedagogical University. Series "Pedagogy and Psychology". 2019;(2(34)):8–19. https://doi.org/10.25688/2076-9091.2019.34.2.1

7. Mohiuddin AK. Chemistry of Secondary Metabolites. Annals of Clinical Toxicology. 2019 Jan 29;2. http://doi.org/10.25107/2641-905X-v2-id1014

8. Apostolova S, Oreshkova T, Uzunova V, Georgieva I, Maslenkova L, Tzoneva R. A Standardized Extract of Petasites hybridus L., Containing the Active Ingredients Petasins, Acts as a Pro-Oxidant and Triggers Apoptosis through Elevating of NF-κB in a Highly Invasive Human Breast Cancer Cell Line. Front Biosci (Landmark Ed). 2023 Jun 12;28(6):111. https://doi.org/10.31083/j.fbl2806111

9. Matsumoto T, Imahori D, Saito Y, Zhang W, Ohta T, Yoshida T, et al. Cytotoxic activities of sesquiterpenoids from the aerial parts of Petasites japonicus against cancer stem cells. J Nat Med. 2020 Sep;74(4):689–701. https://doi.org/10.1007/s11418-020-01420-x

10. Кутилин Д. С., Кечерюкова М. М. От биоинформационного скрининга генетических маркёров к малоинвазивной диагностике метастазов в лимфатических узлах у пациенток с раком шейки матки. Казанский медицинский журнал. 2022;103(5):725–736. https://doi.org/10.17816/KMJ2022-725, EDN: OTTJXB

11. Тимофеева С. В., Филиппова С. Ю., Ситковская А. О., Гненная Н. В., Межевова И. В., Шамова Т. В. и др. Биоресурсная коллекция клеточных линий и первичных опухолей ФГБУ НМИЦ онкологии Минздрава России. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2022;21(11):44–50. https://doi.org/10.15829/1728-8800-2022-3397, EDN: MWVYOR

12. Bouabdallah S, Al-Maktoum A, Amin A. Steroidal Saponins: Naturally Occurring Compounds as Inhibitors of the Hallmarks of Cancer. Cancers (Basel). 2023 Jul 31;15(15):3900. https://doi.org/10.3390/cancers15153900

13. Pang J, Vince JE. The role of caspase-8 in inflammatory signalling and pyroptotic cell death. Semin Immunol. 2023 Nov;70:101832. https://doi.org/10.1016/j.smim.2023.101832

14. Voskarides K, Giannopoulou N. The Role of TP53 in Adaptation and Evolution. Cells. 2023 Feb 3;12(3):512. https://doi.org/10.3390/cells12030512

15. Hao Q, Chen J, Lu H, Zhou X. The ARTS of p53-dependent mitochondrial apoptosis. J Mol Cell Biol. 2023 Mar 29;14(10):mjac074. https://doi.org/10.1093/jmcb/mjac074

16. Wang H, Nicolay BN, Chick JM, Gao X, Geng Y, Ren H, et al. The metabolic function of cyclin D3-CDK6 kinase in cancer cell survival. Nature. 2017 Jun 15;546(7658):426–430. https://doi.org/10.1038/nature22797